Para el análisis cualitativo se pesaron 10 g de miel y se disolvieron con agua destilada hasta un volumen final de 30 ml. A continuación, se centrifugó a 4500 r.p.m. (3383 g) durante 10 minutos (centrifugación I). Se eliminó el sobrenadante con una pipeta, y de nuevo se llevó hasta un volumen de 30 ml con agua destilada y se centrifugó a 4500 r.p.m. durante 5 minutos (centrifugación II). Una vez finalizada la segunda centrifugación se decantó de nuevo el sobrenadante, se añadieron 500 μl de agua destilada y se agitó el sedimento para homogenizarlo.
Seguidamente se calentó la placa calefactora a 60 oC sobre la que se depositaron los portaobjetos. Se tomó un volumen de 100 μl, que se depositó en un portaobjetos debidamente etiquetado sobre placa calefactora y se dejó secar. Sobre cada portaobjetos se depositó un cubreobjetos con una gota de solución colorante de fucsina.
Las preparaciones se analizan en un microscopio óptico Motic y se realiza la documentación fotográfica sistemática de las muestras a al menos dos aumentos diferentes (objetivos 20x y 100X) A ALTA RESOLUCIÓN.
La identificación de los pólenes se realizará utilizando por una parte la palinoteca experimental generada con anterioridad, y/o utilizando las claves de identificación polínica (Punt, 1976; Moore & Webb, 1978; Punt & Clarke, 1980; Walter et al., 1983; Valdés et al., 1987; Punt & Clarke, 1984; Punt et al., 1988; Punt & Blackmore, 1991), así como las bases de datos
Una vez reconocido el polen, se clasificará por su nivel taxonómico en especie, género o tipo. Este último indica una morfología afín para distintos géneros, principalmente dentro de una misma familia. Se nombrarán con género y especie aquellos pólenes que ciertamente se corresponden con una especie vegetal y se adoptará el nombre genérico cuando el polen que se describe sea común para varias especies de un mismo género.
Las cantidades serán expresadas:
a) Según la nomenclatura de ZANDER, que se utiliza para expresar la abundancia
relativa de cada polen en la miel, agrupando los tipos polínicos en clases de dominancia:
D: Polen dominante: representa más de 45% del total.
A: Polen acompañante: representa del 15% al 45% del total.
I: Polen aislado importante: representa del 3% al 15% del total.
R: Polen raro o esporádico: representa menos del 3%.
b) En términos absolutos, referidos a 1 gr de miel, según la escala de clases de Maurizio: Granos de polen por gramo de miel
I < 2000
II 2000-10000
III 10000-50000
IV 50000-100000
V > 100000
ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE ELEMENTOS NO POLÍNICOS.
Los métodos anteriores se utilizarán igualmente para la detección y cuantificación de elementos diferentes a pólenes (esencialmente esporas e hifas fúngicas y células y esporas de levaduras).
Para la identificación de hongos se utilizarán diferentes referencias bibliográficas como: Nilsson, (1983), Grant-Smith, (1990), Barnett et al., (2000). La descripción y características de la morfología de la levadura Metschnikowia fue detallada por Giménez-Jurado, (1992) que las describe como células en forma de avión. El trabajo de microbiota del polen del año anterior igualmente describe distintas morfologías de levaduras.